達(dá)立通顆粒整體質(zhì)量研究進(jìn)展（十七）
發(fā)布時(shí)間：2024-05-26 18:34:07 | 來(lái)源：【藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì) 2024-5-26】
依據(jù)《中藥復(fù)方制劑整體質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建及應(yīng)用》中關(guān)于構(gòu)建中藥復(fù)方制劑整體質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的技術(shù)路線(xiàn)，按照《達(dá)立通顆粒整體質(zhì)量研究方案》，開(kāi)展達(dá)立通顆粒整體質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，包括研發(fā)立項(xiàng)研究、組方和方解研究、中藥材/飲片質(zhì)量研究、生產(chǎn)過(guò)程控制技術(shù)研究、作用機(jī)制研究、質(zhì)量標(biāo)志物和生物標(biāo)志物研究、循證醫(yī)學(xué)研究、藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)研究。根據(jù)項(xiàng)目進(jìn)展情況，我們將陸續(xù)報(bào)道相關(guān)研究成果。
本期主要探討達(dá)立通顆粒治療功能性便秘的作用。
功能性消化不良（FD）是指位于上腹部的一個(gè)或一組癥狀，主要包括上腹部疼痛、上腹部燒灼感、餐后飽脹和早飽感、惡心、嘔吐、噯氣等慢性消化不良癥狀，但其臨床表現(xiàn)不能用器質(zhì)性、系統(tǒng)性或代謝性疾病等來(lái)解釋的胃腸疾病，其發(fā)病機(jī)制與內(nèi)臟高敏反應(yīng)、精神情志、胃腸動(dòng)力改變、胃排空延遲、十二指腸屏障功能障礙、胃腸道分泌功能改變、膽汁酸吸收不良、腸道微生物失調(diào)和腸腦軸改變、遺傳因素等相關(guān)。
功能性便秘（FD）是一種以排便困難、排便次數(shù)減少或排便不盡為主要表現(xiàn)，且不符合便秘型腸易激綜合征（IBS-C）的功能性腸?。‵BDs），屬于胃腸動(dòng)力障礙性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與生活方式、飲食、精神情志、胃腸動(dòng)力改變、胃排空延遲、結(jié)腸傳輸功能障礙、盆底肌群運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、腸道敏感性異常、腸道微生物失調(diào)、腸腦軸改變、腸神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)改變、遺傳因素等相關(guān)。功能性消化不良患者常伴有功能性便秘，極大地影響患者的正常工作和生活。
侯葉廷等通過(guò)對(duì)63例功能性消化不良患者、34例功能性便秘患者、46例功能性消化不良伴功能性便秘患者以及40例無(wú)消化道癥狀的健康體檢者的研究發(fā)現(xiàn)，功能性消化不良患者和功能性便秘患者都存在胃排空延遲，即都存在胃腸動(dòng)力異常，功能性胃腸病可能存在共同的發(fā)病機(jī)制，相同的病理生理可存在于胃腸道的多個(gè)部位，其中胃腸動(dòng)力異常就是其中可能的共同機(jī)制之一；另一方面，胃腸道不同部位具有類(lèi)似的發(fā)病機(jī)制，如內(nèi)臟高敏反應(yīng)、傳輸減慢等，則應(yīng)針對(duì)共同的病理生理機(jī)制進(jìn)行干預(yù)。對(duì)于功能性消化不良、功能性便秘、功能性消化不良伴功能性便秘患者給予促胃腸動(dòng)力藥物治療，可以很大程度緩解便秘及上腹部癥狀，為達(dá)立通顆粒治療功能性消化不良、功能性便秘、功能性消化不良伴功能性便秘提供了臨床試驗(yàn)依據(jù)。
達(dá)立通顆粒是促胃腸動(dòng)力中藥，用于治療動(dòng)力障礙型功能性消化不良所致的胃脘脹滿(mǎn)、噯氣、納差、胃中灼熱、嘈雜泛酸、脘腹疼痛、口干口苦等。蘇艷等研究結(jié)果表明，達(dá)立通顆粒能顯著促進(jìn)功能性消化不良模型大鼠、斑馬魚(yú)的胃腸運(yùn)動(dòng)和胃排空，顯著改善模型動(dòng)物消化不良癥狀；橙皮苷等黃酮類(lèi)化合物是達(dá)立通顆粒促進(jìn)胃腸動(dòng)力和胃排空治療動(dòng)力障礙型功能性消化不良的主要藥效成分。 占煜等研究結(jié)果表明，橙皮苷可通過(guò)上調(diào)結(jié)腸ANO1、c-kit、PDGFRα、P2Y1、SK3表達(dá)水平，恢復(fù)Cajal間質(zhì)細(xì)胞和PDGFRα+細(xì)胞的表型及功能，改善SIP合胞體功能及結(jié)腸動(dòng)力，從而干預(yù)便秘大鼠，為達(dá)立通顆粒治療功能性消化不良、功能性便秘、功能性消化不良伴功能性便秘提供了理論依據(jù)。以下是占煜等關(guān)于橙皮苷改善洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘大鼠結(jié)腸SIP合胞體功能的研究報(bào)告。
腸道動(dòng)力本質(zhì)上取決于平滑肌細(xì)胞（SMC）的興奮性。作為胃腸道時(shí)相性收縮即慢波（SW）的起搏點(diǎn)和傳導(dǎo)者Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）、血小板衍生因子受體α陽(yáng)性細(xì)胞（PDGFRα+cells）與SMC通過(guò)縫隙連接、電藕合共同構(gòu)成SIP合胞體（SIP syncytium）。據(jù)報(bào)道，SIP合胞體功能與腸道動(dòng)力密切相關(guān)，參與胃腸基本電節(jié)律調(diào)控和神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)。傳統(tǒng)中藥在功能性便秘的治療方面占據(jù)重要地位。通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，發(fā)現(xiàn)中藥改善便秘的作用可能與橙皮苷等黃酮類(lèi)有關(guān)。因此，占煜等研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了旨在基于結(jié)腸SIP合胞體功能探討橙皮苷干預(yù)洛哌丁胺誘導(dǎo)的大鼠便秘相關(guān)作用機(jī)制研究。
一、材料與方法
（一）動(dòng)物納入及排除標(biāo)準(zhǔn)
1、納入標(biāo)準(zhǔn)
選用SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，5周齡，體重 125～140 g，進(jìn)食、飲水、排便、活動(dòng)等均正常。
2、排除標(biāo)準(zhǔn)
體重不達(dá)標(biāo)或進(jìn)食、飲水、排便、活動(dòng)等不正常的大鼠。
（二）樣本量計(jì)算方法
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行各組大鼠間各項(xiàng)指標(biāo)的比較進(jìn)行樣本量估算。
（三）動(dòng)物
本實(shí)驗(yàn)在四川生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院完成，36只5周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體重125～140g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（川）2018-076，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)頒發(fā)，適用范圍為屏障環(huán)境大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度20～26℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)為每小時(shí)15次，空氣潔凈度7級(jí)，12/12h的晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核［（2021）106號(hào)］，符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定。
（四）藥物
鹽酸洛哌丁胺膠囊（2mg/粒，批號(hào)：LB J8215）由西安楊森制藥有限公司提供。聚乙二醇4000散（10g/袋，批號(hào)：P21731）由馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。橙皮苷（300 mg/盒，批號(hào)：21060909），含量為99.48%，由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供。
（五）主要試劑及儀器
鈣激活氯通道蛋白（ANO1）抗體（美國(guó)Bioss公司，bs-3794R）。酪氨酸受體激酶蛋白（c-kit）抗體（英國(guó)Abcam公司，ab231780）。PDGFRα 抗體（江蘇Affinity公司，AF0241）。P2嘌呤受體1（P2Y1）抗體（江蘇Affinity公司，DF10258）。KCNN3/SK3 通道蛋白（SK3）抗體（江蘇Affinity公司，DF13233）。PDGFRα-蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5）抗體（江蘇 Affinity 公司，DF6854）。水合氯醛（上海Aladdon 公司#C104202）。引物（上海生工生物工程股份有限公司）。正置熒光顯微鏡（日本尼康，Nikon ECLIPSE C1）、成像系統(tǒng)（日本尼康，Nikon DS-U3）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，ChemiScope 610）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽洛捷克，SCILOGEX D3024）、高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾生物，KZ-III-F）、全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療科技有限公司，SLAN-96S）、電泳儀（美國(guó) Bio-Rad Laboratories, PowerPac Basic）、光譜儀（美國(guó)伯滕 Bio Tek,μ Quant）等。
（六）動(dòng)物造模及干預(yù)方法
根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》計(jì)算大鼠等效劑量，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究基礎(chǔ)，35只Wistar大鼠以鹽酸洛哌丁胺（1.5 mg/kg）灌胃，1天2次建立便秘模型，干預(yù)時(shí)間為9:00和18:00。通過(guò)一般情況、排便情況、糞便性狀、糞便含水量、首粒黑便時(shí)間驗(yàn)證造模成功。造模過(guò)程中無(wú)死亡，造模成功31只，成功率88.6%。選取30只用于后續(xù)試驗(yàn)。
將所有Wistar大鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7天后采集基線(xiàn)數(shù)據(jù)，選取造模成功的Wistar大鼠30只隨機(jī)分為模型組、橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量組、橙皮苷高劑量組、聚乙二醇4000散干預(yù)組（簡(jiǎn)稱(chēng)西藥組），每組6只，單獨(dú)飼養(yǎng)于代謝籠中。另設(shè)空白組6只予以造模藥等量的生理鹽水灌胃14天，在最后7天同時(shí)予以干預(yù)藥等量的生理鹽水灌胃。模型組予以洛哌丁胺溶液灌胃14天，在最后7天同時(shí)予以干預(yù)藥等量的生理鹽水灌胃。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)置橙皮苷低、中、高劑量組予以洛哌丁胺溶液灌胃14天，在最后7天同時(shí)予以橙皮苷混懸液［低劑量組：50 mg/（kg·d）；中劑量組：100 mg/（kg·d）；高劑量組200 mg/ （kg ·d），分別相當(dāng)于成人用量的1、2、4倍］灌胃，干預(yù)時(shí)間為13:30。西藥組予以洛哌丁胺溶液灌胃14天，在最后7天同時(shí)予以聚乙二醇4000散［0.9g/（kg·d）]灌胃，干預(yù)時(shí)間為13:30。
末次給藥后6h（24:00）左右集體處死大鼠，頸椎脫臼處死大鼠后迅速剖腹，截取所需位置及質(zhì)量的結(jié)腸腸段組織，PBS緩沖液輕柔洗凈后，立即置于液氮罐內(nèi)，-80℃冰箱保存組織。
（七）檢測(cè)指標(biāo)及方法
1、一般情況
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察并記錄各組大鼠的一般情況，記錄每天實(shí)驗(yàn)前后的體重、進(jìn)食量、排便情況等。
2、首粒黑便時(shí)間
于第1天和第14天清晨（7:00），均給予大鼠10 mL/kg 的墨汁灌胃，記錄準(zhǔn)確灌胃時(shí)間及首粒黑便排出時(shí)間，得出間隔時(shí)間。
3、糞便含水量的檢測(cè)
及時(shí)收集第1天和第14 天實(shí)驗(yàn)前（0:00～7:00）所有糞便排泄物，將糞便（含離心管）稱(chēng)重（濕重）后置于37 ℃溫箱中干燥5天，稱(chēng)干燥后糞便（含離心管）重量（干重），按以下公式計(jì)算糞便含水量。糞便含水量（%）=（濕重﹣干重）/（濕重﹣離心管重）x100%。
4、ELISA檢測(cè)結(jié)腸組織中5﹣羥色胺（5-HT）及5﹣羥色胺4型受體（5-HT4R）含量
截取100mg結(jié)腸組織，剪成小塊放入組織研磨器中，加入1mL PBS，制成勻漿，置于﹣20℃冰箱過(guò)夜。經(jīng)反復(fù)凍融2次破壞細(xì)胞膜后，將組織勻漿以2～8℃，5000xg，離心5 min，取上清。取適量上清液立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免反復(fù)凍融。操作步驟嚴(yán)格按照5-HT、5-HT4R EIA kit 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
5、HE染色
結(jié)腸組織樣本經(jīng)4％多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，嚴(yán)格按照病理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOP程序進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片最后鏡檢合格的樣片，厚度3μm。從3個(gè)橙皮苷干預(yù)組中選取便秘表型改善最為明顯的1個(gè)組大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行檢測(cè)及比較，下同。
6、Western Blot 檢測(cè)結(jié)腸組織中PDGFRαP2Y1、c-kit、SK3、ANO1蛋白水平
截取的Wistar大鼠結(jié)腸組織放入RIPA裂解液中于冰上裂解10min，裂解完成后以12000xg離心力離心10 min，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配置濃縮膠和12％分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在S1模式電壓80V和S2模式120V電壓下分離，200mA將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉液室溫?fù)u床封閉1h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜PDGFRα （1:1 000 ），KCNN3 （1: 1 000）, ANO1 （1:1 000 ）, P2Y12（1:1 000 ）, c-kit（1:1 000）。TBST 漂洗后加入二抗（HRP標(biāo)記山羊抗兔lgG）（1:10 000），室溫孵育1 h，再次TBST漂洗。PVDF 膜的蛋白面朝上放在樣本托盤(pán)上，ECL（BL520B）與此混合液充分接觸，在圖像采集軟件下采集圖像，使用勤翔化學(xué)分析軟件進(jìn)行灰度分析。
7、qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO1的mRNA水平
截取距盲腸2cm新鮮近端結(jié)腸組織150mg，采用Tripure一步法提取細(xì)胞RNA，取2μLRNA加入98μL DEPC﹣水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品在260nm和280nm處的OD值，以在1.8～2.0之間為合格。以RNA為模版反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按總體積20μL（順序：上游引物1.0 μL、下游引物1.0μL、FastStart Universal SYBR Green Master 10.0 μL、cDNA模版5.0 μL、H2O 3.0 μL）加待測(cè)樣品基因反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，循環(huán)1次；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72℃ 30s，循環(huán)40次；最后加熔解曲線(xiàn)（95℃ 15s、60℃ 15s，逐漸升至95℃超過(guò)30 min）。在PCR儀上反應(yīng)，每份樣品3個(gè)復(fù)孔測(cè)定，設(shè)陰性、空白對(duì)照。通過(guò)分析軟件得到樣品閾值循環(huán)數(shù)（CT）和相對(duì)的拷貝定量，再進(jìn)行樣本之間的比較。采用2ΔΔct方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，△ Ct＝目的基因Ct﹣內(nèi)參基因Ct；△ △ Ct＝干預(yù)組△ Ct﹣空白組△ Ct；相差倍數(shù)＝2ΔΔct，對(duì)照組的數(shù)值設(shè)為100%。
8、免疫熒光（雙重染色）檢測(cè)結(jié)腸組織中ANO1-PDGFRα和 PDGFRα-PGP9.5 的表達(dá)
分別脫蠟至水：依次將石蠟切片放入二甲苯I15 min﹣二甲苯II 15 min﹣無(wú)水乙醇I 5 min﹣無(wú)水乙醇II 5 min-85％酒精5 min-75％酒精5 min﹣蒸餾水洗?？乖迯?fù)：置于盛滿(mǎn) EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8 min?；? min轉(zhuǎn)中低火7 min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。畫(huà)圈自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后用組化筆在組織周?chē)?huà)圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。血清封閉：在圈內(nèi)滴加BSA孵育30 min。加一抗（PDGFRα）后將切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。加二抗（ANO1或蛋白基因產(chǎn)物9.5/PGP9.5）：玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。封片：玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像（DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330～380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465～495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510～560,發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光）。
（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 28.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)以x（均值）±s表示。滿(mǎn)足正態(tài)性和方差齊性的多組之間均數(shù)比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD法，方差不齊者采用Dunnett's T3檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)結(jié)果用GraphPad prism8.0制作圖形。
二、結(jié)果
（一）一般情況
造模前各組大鼠均活潑好動(dòng)，皮毛光澤度好，糞便呈連續(xù)條狀，質(zhì)軟且表面水分較多。第3～7天，模型組和各干預(yù)組均出現(xiàn)活動(dòng)量減少，皮毛光澤度變黯淡，糞粒干硬、粒形縮短，排便量下降，模型組上述表現(xiàn)持續(xù)至第14天，而各干預(yù)組第9～10天后癥狀逐漸改善，尤其橙皮苷中、高劑量干預(yù)組和西藥組第 13～14天糞粒性狀與空白組相近。
（二）各組體重和進(jìn)食量比較
與本組干預(yù)第1天比較，各組第14天大鼠的體重均有增長(zhǎng)（P<0.01），組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各組大鼠進(jìn)食量干預(yù)前后及組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
（三）各組糞便含水量和首粒黑便時(shí)間比較
與空白組同期比較，第14天模型組糞便含水量降低（P<0.05），首粒黑便時(shí)間延長(zhǎng)（P<0.01）；與模型組同期比較，干預(yù)第14天橙皮苷中、高劑量組和西藥組的糞便含水量增加（P<0.05，P<0.01），首粒黑便時(shí)間縮短（P<0.05,P<0.01）；第14天各干預(yù)組組間兩兩比較，橙皮苷高劑量組的糞便含水量高于低劑量組，首粒黑便時(shí)間短于低劑量組（P<0.05），余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
（四）各組結(jié)腸組織5-HT和5-HT4R含量比較
與空白組比較，模型組結(jié)腸5-HT和5-HT4R含量均降低（P<0.05）；與模型組比較，橙皮苷中、高劑量組結(jié)腸5-HT 和 5-HT4R含量均升高（P<0.05，P<0.01）；各干預(yù)組組間兩兩比較，橙皮苷高劑量組結(jié)腸5-HT和5-HT4R 含量均高于低劑量組和西藥組（P<0.05），橙皮苷中劑量組結(jié)腸5-HT4R含量高于西藥組（P<0.05），余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
（五）各組結(jié)腸病理結(jié)果比較
橙皮苷高劑量組的療效最為顯著，故選擇空白組、模型組和橙皮苷高劑量組的結(jié)腸組織進(jìn)行檢測(cè)及比較。空白組和橙皮苷高劑量組：結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)清晰緊密，黏膜上皮完整，腸腺豐富，排列整齊，腸腺上皮中杯狀細(xì)胞清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)明顯其他異常。模型組大鼠結(jié)腸黏膜層上皮壞死脫落，腸腺局灶性壞死，黏膜肌層肌纖維腫脹變厚；黏膜下層重度水腫，結(jié)締組織疏松，其內(nèi)淋巴管擴(kuò)張，管腔內(nèi)大量淋巴細(xì)胞，肌層變薄。
（六）3組結(jié)腸組織SIP合胞體標(biāo)記蛋白表達(dá)水平比較
與空白組比較，模型組結(jié)腸PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO 平均降低（P<0.01）；與模型組比較，橙皮苷高劑量組結(jié)腸PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO1蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.01）。
（七）3組結(jié)腸組織SIP合胞體標(biāo)記蛋白mRNA表達(dá)水平比較
與空白組比較，模型組結(jié)腸PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO1mRNA水平均降低（P<0.01）；與模型組比較，橙皮苷高劑量組結(jié)腸PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO1 mRNA水平均升高（P<0.01）。
（八）3組大鼠免疫熒光結(jié)果比較
空白組大鼠結(jié)腸中PDGFRa 陽(yáng)性（紅光）和ANO1陽(yáng)性（綠光）主要共表達(dá)在肌間和肌層，二者似呈伴行、毗鄰的關(guān)系，而在黏膜、黏膜下層僅有少量表達(dá)。橙皮苷高劑量組與空白組相似，且PDGFRα與ANO1共表達(dá)更為明顯。相較于空白組和橘皮苷高劑量組，模型組陽(yáng)性染色明顯減少，在結(jié)腸肌間和肌層有少量表達(dá)。
空白組大鼠結(jié)腸中PDGFR& 陽(yáng)性（紅光）和PGP9.5 陽(yáng)性（綠光）主要共表達(dá)在肌間和肌層，且呈伴行、毗鄰的關(guān)系，而在黏膜、黏膜下層亦有少量表達(dá)，橙皮苷高劑量組與空白組相似。相較于空白組和橙皮苷高劑量組，模型組陽(yáng)性染色明顯減少，在結(jié)腸肌間和肌層僅有少量表達(dá)。
三、討論
中醫(yī)藥在便秘的治療中占據(jù)重要地位，許多中藥及中藥復(fù)方均具有導(dǎo)瀉通便或調(diào)節(jié)腸道功能等作用。枳實(shí)是達(dá)立通顆粒的君藥，橙皮苷是枳實(shí)中含量最高的活性成分，能有效激活H1阻胺受體，具有顯著的促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)作用。
洛脈丁胺灌胃是目前行之有效的功能性便秘造模方式之。據(jù)報(bào)道，洛哌丁胺可導(dǎo)致結(jié)腸肌層變薄、杯狀細(xì)減少，腸絨毛及黏膜上皮壞死脫落，絨毛排列松散，分腺體結(jié)構(gòu)消失，固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。在相關(guān)研究中，洛哌丁胺造模導(dǎo)致的病理改變與之前報(bào)道相吻合，且大鼠腸道傳輸減慢，符合功能性便秘表型。研究表明，功能性便秘模型大鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)發(fā)生明顯改變，但橙皮苷干預(yù)后黏膜上皮的壞死脫落及炎癥侵潤(rùn)現(xiàn)象得到明顯改善，腸道傳輸明顯加快。大鼠的便秘癥狀得到明顯好轉(zhuǎn)，證實(shí)了橙皮苷對(duì)大鼠功能性便秘確有療效。
SIP合胞體對(duì)于胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)具有重要意義。盡管橙皮苷治療功能性便秘的效果與聚乙二醇4000散類(lèi)似，但二者的作用機(jī)制并不相同。5-HT作為一種重要的腸神經(jīng)遞質(zhì)，其信號(hào)系統(tǒng)廣泛參與調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)、蠕動(dòng)、分泌和感覺(jué)。5-HT受體脫敏及信號(hào)減弱與功能性便秘發(fā)病有關(guān)。多項(xiàng)研究提示橙皮苷可通過(guò)增5-HT信號(hào)促進(jìn)腸動(dòng)力。與之相吻合的是，橙皮苷干預(yù)顯著上調(diào)了功能性便秘大鼠結(jié)腸組織中5-HT和5-HT4R的表達(dá)。提示橙皮苷可激活5-HT信號(hào)，改善SIP合胞體功能促進(jìn)腸動(dòng)力進(jìn)而治療便秘，但其分子機(jī)制和信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。而聚乙二醇4000散對(duì)5-HT信號(hào)無(wú)明顯作用，其主要是通過(guò)內(nèi)滲透壓改善便秘。
據(jù)報(bào)道，結(jié)腸存在多種ICC亞型，其中肌間型和黏膜下層型為構(gòu)成SIP合胞體的主要亞型。通常，腸運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)末梢含多種神經(jīng)遞質(zhì)，釋放后擴(kuò)散到鄰近SIP合胞體發(fā)揮效應(yīng)。興奮性遞質(zhì)如乙酰膽堿（Ach）、P物質(zhì)（SP），結(jié)合ICC上特定受體（如M3、NK1）后，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，激活ANO1，引起ICC去極化而導(dǎo)致SMC收縮。相反，抑制性遞質(zhì)如一氧化氮（NO）、β-NAD，可結(jié)合PDGFRα＋細(xì)胞上特定受體（如sGC、P2Y1）后引起超極化，導(dǎo)致SMC舒張。小鼠結(jié)腸中PDGFRα+細(xì)胞及SMC過(guò)度超極化可引起結(jié)腸慢傳輸。SMC的收縮與舒張直接影響著 SW的強(qiáng)度。有研究證實(shí)慢傳輸型功能性便秘患者結(jié)腸ICC細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其保留的SW無(wú)法與推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)同步及協(xié)調(diào)。因此ICC與PDGFRα＋細(xì)胞的表型維持對(duì)逆轉(zhuǎn)功能性便秘至關(guān)重要。
PGP 9.5是一種反映神經(jīng)元密度的泛神經(jīng)元標(biāo)志物，在黏膜下和肌間神經(jīng)叢中均有表達(dá)。在本研究中，ANO1被用于標(biāo)記ICC，PDGFRα被用于標(biāo)記PDGFRα＋細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度顯示二者在結(jié)腸中的分布。結(jié)果顯示，便秘大鼠結(jié)腸中PGP9.5陽(yáng)性染色明顯減少，ANO1、PGP9.5均與PDGFRα呈現(xiàn)共表達(dá)、伴行、毗鄰的分布特點(diǎn)。提示ICC和PDGFRα＋細(xì)胞與ENS的腸內(nèi)神經(jīng)伴行和毗鄰，SIP合胞體受ENS神經(jīng)﹣內(nèi)分泌信號(hào)調(diào)控，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。然而，橙皮苷高劑量顯著上調(diào)了ICC 和PDGFRα ＋細(xì)胞的表達(dá)，為功能性便秘治療提供了細(xì)胞物質(zhì)基礎(chǔ)。
ICC特異性高表達(dá)c-kit信號(hào)對(duì)于ICC表型維持至關(guān)重要，嚴(yán)重影響SMC起搏及傳導(dǎo)功能。ANO1激活后引起自發(fā)性瞬時(shí)去極化，產(chǎn)生SW，激活SMC上的L﹣型鈣通道而引發(fā)平滑肌收縮。PDGFRα＋細(xì)胞特異性嘌呤類(lèi)遞質(zhì)P2Y1受體和小電導(dǎo)鈣激活鉀通道3（SK3）激活后的效應(yīng)與ANO1相反。二者互作共同維持SW強(qiáng)度。因此，ANO1、PDGFRα、c-kit、P2Y1、SK3表達(dá)水平低反映ICC和PDGFRα＋細(xì)胞數(shù)量減少，SIP合胞體活性下降與結(jié)腸動(dòng)力障礙。然而，橙皮苷干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了功能性便秘大鼠結(jié)腸組織中標(biāo)志物蛋白（PDGFRα、ANO1）和功能蛋白（P2Y1、c-kit、SK3、ANO1）的下調(diào)。反映了橙皮苷促進(jìn)了SIP合胞體表型及功能，腸動(dòng)力的恢復(fù)。綜上，研究提示橙皮苷可通過(guò)可激活結(jié)腸5-HT信號(hào)，上調(diào)ANO1、c-kit、PDGFRα 、P2Y1 和SK3 的表達(dá)水平，恢復(fù)ICC和PDGFRα＋細(xì)胞的表型及功能，改善SIP合胞體功能及結(jié)腸動(dòng)力，從而對(duì)洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘大鼠起到干預(yù)作用。為功能性便秘、功能性消化不良、功能性便秘伴功能性消化不良乃至功能性腸病的治療提供新思路。
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